组织酶消化

niwanmao

heybibna 发表于 2021-8-20 16:24
感谢老师一直耐心讲解，我终于圈出来G2期，但是还有一个问题想请教您一下，按这个圈门和拟合方法，之前做 ...

结果接近就OK了。这个差异是人为的设置造成的，此时，以RCS小者作为优选。

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-22 11:03
结果接近就OK了。这个差异是人为的设置造成的，此时，以RCS小者作为优选。 ...

好的，明白了，谢谢老师，还有一个问题得请教您，我按这个圈门拟合的方法做了肝脏，结果有点不太一样，右边很明显出现了竖线，有一个分组G2期比例太少，不知道是不是前期处理的不太正确导致的，下面是两个分组的圈门图，还有fcs文件，麻烦老师再给看一下

niwanmao

heybibna 发表于 2021-8-22 21:32
好的，明白了，谢谢老师，还有一个问题得请教您，我按这个圈门拟合的方法做了肝脏，结果有点不太一样，右 ...

这条竖线，在其它样本中也有，只不过肝脏明显一些，因为肝脏细胞活力容易受影响，导致异常强的假阳性。

只有你得参考其它样本的 范围，设置R2，不要圈太大。

heybibna

niwanmao 发表于 2021-8-23 08:03
这条竖线，在其它样本中也有，只不过肝脏明显一些，因为肝脏细胞活力容易受影响，导致异常强的假阳性。

...

谢谢老师前期耐心指导，受益良多，关于实验还有几个问题向您请教一下，[流式protocol] PI检测细胞周期（乙醇固定，Triton X-100打孔） 这个方法里面，配好的染液避光能保存多长时间，每次染不了10个样，之前都是避光四度保存，第二天再染效果不太好，细胞染上色的更少了。也试过配置5个样的用量，triton不好控制挂枪头，您这里有什么小技巧吗？下面这个是按之前已经做出来的方法换了个脏器，但是圈出来还是有点问题，麻烦您看一下。

niwanmao

heybibna 发表于 2021-11-6 22:58
谢谢老师前期耐心指导，受益良多，关于实验还有几个问题向您请教一下，[流式protocol] PI检测细胞周期（乙 ...

1、染液成份里面，RNA酶是否已加？
2、细胞是否经过计数？细胞数和染液的比例是否恒定？
这两个因子都会影响染色结果。

至于Triton，可用反向加样法实现准确加样。

heybibna

niwanmao 发表于 2021-11-7 08:37
1、染液成份里面，RNA酶是否已加？
2、细胞是否经过计数？细胞数和染液的比例是否恒定？
这两个因子都会 ...

老师，染色里面RNA酶已加，不过因为RNase不是DNase-free，所以用的是2 mg RNase A在1 ml蒸馏水中煮沸5分钟这个方法，然后按比例加到染液里的，细胞经过计数，每个样本细胞数大概是1*10的7次方左右，每次都是加了1mlDNA染液这样操作的。

niwanmao

heybibna 发表于 2021-11-7 09:55
老师，染色里面RNA酶已加，不过因为RNase不是DNase-free，所以用的是2 mg RNase A在1 ml蒸馏水中煮沸5分 ...

如果都按正确步骤做，不会有问题。

heybibna

niwanmao 发表于 2021-11-7 18:57
如果都按正确步骤做，不会有问题。

老师，方法上说取1x10的6 细胞/管，我最后上机是1x10的7细胞，是不是需要增加染液的量？还有一个问题是，我做细胞周期的组织样是用保护液冻存在-80里，然后37度水浴融化以后进行酶消化上机染色的，我想咨询一下这个方法会不会影响染色结果？因为统一上机1w的细胞，最后染上色的数量只有一半左右，所以最后上机2w细胞染上色的才能达到8k-9k，这样做的话能接近真实值吗？麻烦老师啦。

niwanmao

heybibna 发表于 2021-11-11 09:07
老师，方法上说取1x10的6 细胞/管，我最后上机是1x10的7细胞，是不是需要增加染液的量？还有一个问题是， ...

我没看懂，你这里究竟上机获取的细胞量是1×10E7还是2万？

heybibna

niwanmao 发表于 2021-11-11 10:10
我没看懂，你这里究竟上机获取的细胞量是1×10E7还是2万？

细胞计数是1×10E7，上流式细胞仪的数量是2w