检测凋亡细胞内ROS的含量

maple032023

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倪老师,我检测完ROS了,如图所示(依次为:con, positive control, 药物作用6h，药物作用24h)。阳性对照有点问题呢,怎么荧光没太增加呢?我阳性对照用H2O2 50uM 处理30min. 老师我这个过氧化氢浓度算得有点蒙，H2O2产品是30% m/m，我算的摩尔浓度将近10M，然后我就用水稀释了100倍，100mM，在3ml培养基里加了1.5微升，终浓度是50uM吧。我用H2O2处理后看了一下细胞形态和control一样，没有什么变化。

niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-29 16:06

                               
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倪老师,我检测完ROS了,如图所示(依次为:con, positive control, 药物作用6h，药物作 ...

过氧化氢不是特别稳定，也可能会在培养时分解了。

这次的结果怎么是降低了呢？跟前面两次不一样嘛。这次做了什么不同的处理？

maple032023

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老师因为这次我测的是ROS啊，这是我第一次测这个，刚刚拿到结果。前几次都是测得线粒体膜电势，结果升高。我觉得这两个结果还挺有联系的，如果可以导致ROS升高的话，一般线粒体膜电势就必须降低了，因为ROS可以直接破坏线粒体膜。而我的药物正好导致了ROS的降低，那么紧接着膜电势升高就不奇怪了，我觉得这个地方好像可以深入讨论一下放在文章里。老师我查了一下有一个测ROS的Kit（附件）里用H2O2作阳性对照，图例正好是用Hela细胞(我的也是)做的，H2O2终浓度1mM的时候才能导致ROS明显的增加。我想可能是细胞类型不一样，ROS作用的不一样。所以我打算再重新做一下，把H2O2浓度提高。嘿嘿，我觉得这个Kit挺好，传上来给大家看看！ STA-342-ROS-assay-kit.pdf (268.96 KB, 下载次数: 85)

2011-6-29 17:02 上传

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niwanmao

maple032023 发表于 2011-6-29 17:05

                               
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老师因为这次我测的是ROS啊，这是我第一次测这个，刚刚拿到结果。前几次都是测得线 ...

SORRY，在这两个问题里面转晕了，我还以为是线粒体膜电位的结果呢，呵呵。
嗯，如此看来，的确是有点关联。
加油。

maple032023

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倪老师,我最近在测光敏剂导致细胞内ROS增加的实验。产生的ROS消失得非常快，有的时候试验结果不好。所以我想能不能原位加DCFH-DA呢？就是药物处理完之后马上加入不含血清培养基稀释的DCFH-DA（终浓度10uM）在培养箱里孵育30min，然后再收集细胞检测，以避免收集细胞的过程中ROS损失。我的细胞是贴壁细胞。

niwanmao

maple032023 发表于 2011-10-10 10:38

                               
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倪老师,我最近在测光敏剂导致细胞内ROS增加的实验。产生的ROS消失得非常快，有的时 ...

我觉得可以试试吧。这东西我没做过，只能从理论上感觉可行。

stef1981

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我们用的碧云天的探针，效果还挺好的，变化也挺明显，荧光很强，短时间不会消失，价格也不贵，可以试试

maple032023

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对对,我也是看了碧云天试剂盒的protocol才知道可以原位装载探针的.不过我现在不在国内买不到这个.我就买了这个探针化合物.

maple032023

原位加载探针是先加载后处理还是先处理后加载呢?我的药物产生活性氧小时非常快,所以我觉得先加探针比较好.但是我又想测活性氧随着时间的变化,如果先装上探针,产生活性氧的时候探针就已经和ROS反应了,之后就算细胞内的ROS减少荧光还会降低吗?

stef1981

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加载探针一半只需半个小时，如果你的药物反应时间短于半个小时就要先加载探针。也可以等药物反应后终止药物，用带血清的培养基洗一遍，再加载探针。这个只能自己摸索