荧光扣除对照（FMO）概念和示例

niwanmao

在流式检测中，设门最好是按照荧光扣除对照来设。那么什么叫荧光扣除对照呢（Fluorescence Minus One，FMO）？FMO对照就是你设计的方案中除了你要检测的目的抗体之外，其它抗体都加上，这种对照可以帮助你衡量其它通道究竟有多少荧光漏到目的通道，从而使你能够更精确地设置阳性/阴性群体界限。
FMO对照在下列情形下尤为重要：1、定量极弱或分群不清的细胞群体。2、在试剂优化时衡量荧光溢漏。
使用FMO对照需要注意：1、荧光完全不重叠的通道之间，不需要。2、无法衡量背景荧光，如果抗体相关的背景非常明显，则不适合再用FMO来设定分界。
下面这个例子提示我们，空白对照不能代替FMO设门：

FMO对照实例

niwanmao

samly0 发表于 2013-4-2 10:08

                               
登录/注册后可看大图

倪老师，我觉得，如果设FMO是为了解决阴阳性细胞分布宽度不一样的问题，那我是不是用单标管调好补偿后以单 ...

我前面说过，如果你是两色，那么你所说的单标管就等于FMO，所以你说的用单标管划门没有错。

但如果是3色（例如FITC/PE/PERCP）呢？例如你用perCP单标管来为PE通道的荧光素设阴性门，那么FITC漏过来的你如何算？如果用FITC单标的设PE的阴性门，PERCP漏过来的如何排除？所以就必须用FMO管，即FITC和PERCP双标的（只有PE扣除掉）的，来设置PE通道的阴性门。

niwanmao

samly0 发表于 2013-04-01 22:13:55

                               
登录/注册后可看大图

这个我明白了，只是还是有点不理解在已经调好补偿后做的fmo图里面，阴性细胞群以外多出的那部分荧光信号是

我们调节补偿是以阳性和阴性细胞群的中心位置对齐为标准，而这两群细胞的分布宽度一般不一样，就像郭版这张图，所以上面分界位置也不一样？

gcz5340

我觉得：荧光补偿后背景荧光会增强是为什么要设置FMO对照的原因，如图中，CD8阳性群体调完补偿后是一个弥散状态，这就会导致CD4背景荧光的增强，所以就应该以FMO对照作为gating control。
补偿虽然能消除荧光之间的光谱重叠，但也会引起背景荧光的增加，颜色越多影响越大，这也是多色实验无法绕开的难题。

niwanmao

samly0 发表于 2013-04-01 16:10:23

                               
登录/注册后可看大图

哦，有点糊涂了，但调节补偿的目的不是去除其他通道漏到被检通道的荧光么？调好补偿后，怎么FMO还能检测得

调节补偿的目的是为了去除漏进来的荧光，但是我后续如何设门，设在哪里才合适呢？就需要根据fmo对照，如果你只有两种颜色，这时单标的就是fmo，但如果更多，就还需要考虑其它颜色对该通道的影响。

samly0

请问在这个FMO中检测到的漏进去的荧光怎么扣除？是通过设门去除还是调补偿去除？这个FMO的作用与我分不同通道的单标抗体调补偿扣除有什么区别？

niwanmao

samly0 发表于 2013-4-1 15:34

                               
登录/注册后可看大图

请问在这个FMO中检测到的漏进去的荧光怎么扣除？是通过设门去除还是调补偿去除？这个FMO的作用与我分不同通 ...

单标主要目的是用于调节补偿。
FMO对照的目的是为了在补偿调节完成之后，分析时能够精确设门而做的。

samly0

哦，有点糊涂了，但调节补偿的目的不是去除其他通道漏到被检通道的荧光么？调好补偿后，怎么FMO还能检测得到漏到的荧光？

samly0

这个我明白了，只是还是有点不理解在已经调好补偿后做的fmo图里面，阴性细胞群以外多出的那部分荧光信号是怎么来的？可能有点钻牛角了，呵呵

samly0

倪老师，我觉得，如果设FMO是为了解决阴阳性细胞分布宽度不一样的问题，那我是不是用单标管调好补偿后以单阳性细胞群的上缘为界划线门，是不是就不需要FMO管了？我比较赞同版主老师的说法，荧光补偿后背景荧光会增强是为什么要设置FMO对照的原因，但是同时我也不明白，既然补偿已经消除荧光之间的光谱重叠，那么它引起的背景荧光信号的增加，是指使重叠范围增大了导致补偿不足出现的信号么？