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聊聊最让你纠结的设门参照

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发表于 2019-1-9 22:48:49 | 显示全部楼层 |阅读模式

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提到设门的参照,很多人第一念头就是空白对照、同型对照。

其实,空白对照是用来初步确定电压的,而非用于设门。一定要明确这点。

至于同型对照,在流式细胞术发展史上可以说是历史悠久,它的作用主要是排除特定亚型荧光素抗体的非特异性染色背景。文章也很多,但在同型对照的选择上,抗体和同型对照的亚型匹配非常重要,如果亚型不匹配,那么结果就会出乎你的意料。例如下图中,三种不同亚型的同型对照,按照推荐用量,结果可见同型对照表达水平相差很大。

                               
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因此,同型对照目前存在以下两方面缺点:
1、每个抗体均会有不同水平的背景染色,这种背景与其结合特异性、抗体浓度、抗体聚集程度、荧光素:抗体比例等因素有关。 所以,要找到一个与抗体背景染色完全匹配的同型对照非常有难度。
2、同型对照无法反映出其它通道渗漏的荧光背景。不过这个缺陷可以通过同型对照加上其它通道的相关抗体来解决(类似于FMO+同型对照)。

综上,挑选同型对照除了要选对物种、亚型,还需要看抗体的结合特异性、浓度等等各种因素,存在很大的随机性。这也是很多FLOWER在实验中发现同型对照物种和亚型都对的,为什么总是比实验标本还强或者比空白对照还弱等诡异现象。此外,我们要知道一点,同型对照是可以用Fc阻断来替代的:http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5510-1-1.html


FMO对照=Fluorescence minus one,即荧光扣除对照,指的是多色实验时,要检测某个荧光通道的表达情况,由于荧光渗漏影响占主要,所以检测时先将该通道的抗体去掉,检测一下其它通道漏到此通道的背景荧光水平,进行正确排除,从而帮助设门。

FMO对照,会让大家有种感觉特别费抗体,例如12色流式,完整的FMO应该如下图,非常壮观:
屏幕快照 2019-01-09 下午10.02.28.png

FMO对照在下列情形下尤为重要:
1、定量极弱或分群不清的细胞群体。
2、在试剂优化时衡量荧光溢漏。
但使用FMO对照需要注意:
1、荧光完全不重叠的通道之间,不需要。
2、无法衡量背景荧光,或抗体相关的背景非常明显,则不适合再用FMO来设定分界。
因此,FMO对照并非如我们想象中那样特别费。

但是,FMO对照就是最好的设门对照了吗?也未必。
在实际检测中,很多人会发现,其实FMO和同型对照都不一定能正确反映阳性和阴性的界限。这是因为有些时候,标本的背景荧光不仅仅由抗体非特异性结合和荧光渗漏两种组成,还可能有其它我们无法预料的背景荧光。此时,或许改用标记相同抗体组合的生物学对照更好。例如做胞内细胞因子的检测时,未刺激的标本基本上不表达细胞因子,就是一个很好的生物学对照。

如下图,三种对照中,生物学对照,用相同的抗体组合标记之后,较好地反映了设门位置,而FMO对照偏低,同型对照则偏高。
2015-05-08_163126.gif


聊到这里,大家应该心里都有数了吧。祝愿实验都顺利,有疑问到流式中文网论坛来交流,不要害羞:)


发表于 3 天前 | 显示全部楼层
在论坛上逛逛可以学到好多东西啊,感谢老师
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