最近也在做CFSE检测小鼠脾淋巴细胞增殖，请大家帮忙分析

wolfrog · 发表于 2013-6-29 21:00:45

本帖最后由 wolfrog 于 2013-6-29 21:11 编辑

我的CFSE实验取自红细胞裂解法分离的正常Balb/c小鼠脾淋巴细胞。
CFSE来自Invitrogen 的CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit (C34554)
染色用1uM CFSE 37度10min染细胞（1×10E6cells/ml，1ml）。
5倍体积10%1640培养液冰上5min终止染色，10%1640洗3次。
在24孔板中培养，5×10E5cells/well，1ml/well。
为维持细胞状态加入了终浓度10ng/ml的IL-2，有的孔还加入了anti-CD3 antibody（终浓度1ug/ml）和anti-CD28 antibody（终浓度0.1ug/ml）。看了别的同仁的帖子http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=2479&extra=&highlight=CFSE&page=1，用抗体包被的方法是不是更好？而且发现这位提问者的抗体浓度比我少很多。
刚染色d0天和之后d1d2d3d4都有从孔中取出一些细胞，持续检测CFSE表达水平。
发现CFSE从d1天开始表达下降就很快，而且活细胞群的比例一直很少。d2,d3,d4都没什么区别了。
请大家看看问题在哪里？
是不是我的哪些处理不当，细胞死的太多了？

niwanmao · 发表于 2013-6-29 23:20:36

你将CFSE孵育的时间减少到5分钟试试？

wolfrog · 发表于 2013-6-30 14:03:15

niwanmao 发表于 2013-6-29 23:20

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你将CFSE孵育的时间减少到5分钟试试？

嗯，谢谢！
还有没有别的要注意的呢？
荧光第一天就下降得特别快是因为细胞活力减低的结果吗？

niwanmao · 发表于 2013-6-30 14:52:26

wolfrog 发表于 2013-6-30 14:03

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嗯，谢谢！
还有没有别的要注意的呢？
荧光第一天就下降得特别快是因为细胞活力减低的结果吗？ ...

其它方面暂时还看不出来。可以一步一步试着看。
@pushiming77 有没有什么建议？

木石织梦 · 发表于 2013-7-1 11:19:00

我觉得一是细胞状态很重要，染CFSE前要计数，活力测定。我一般是活力达95%以上才往下做。种板前也会做一次活力鉴定。二是胎牛血清要灭活。

samly0 · 发表于 2013-7-2 09:22:51

细胞看起来都没活化成，请问从取小鼠脾脏开始到最后铺板成功一共花了多长时间？原代细胞体外处理的时间也是越快越好的，另外建议CFSE的孵育时间再短点。

wolfrog · 发表于 2013-7-2 14:46:21

samly0 发表于 2013-7-2 09:22

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细胞看起来都没活化成，请问从取小鼠脾脏开始到最后铺板成功一共花了多长时间？原代细胞体外处理的时间也是 ...

我直接在培养液里加CD3和CD28抗体，最终浓度分别是1ug/ml, 0.1ug/ml，这样活化效果如何？是不是用抗体包板的方法更好？
我是从杀鼠一直到最后铺板大约5-6小时。
下次我就准备37度孵育CFSE时间减少到5min

wolfrog · 发表于 2013-7-2 14:47:54

木石织梦发表于 2013-7-1 11:19

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我觉得一是细胞状态很重要，染CFSE前要计数，活力测定。我一般是活力达95%以上才往下做。种板前也会做一次 ...

请问您是怎么做活力测定的呢，用台畔蓝染色吗？

samly0 · 发表于 2013-7-2 15:13:30

wolfrog 发表于 2013-7-2 14:46

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我直接在培养液里加CD3和CD28抗体，最终浓度分别是1ug/ml, 0.1ug/ml，这样活化效果如何？是不是用抗体包 ...

我们从杀鼠到铺板就2-3个小时呀，原代细胞体外操作的时间越短活性越好，操作步骤上应该没有啥太大的区别，你看看实验过程是不是有些过程可以统筹安排一下时间，以前我们几个实验一起做都是事先先计划好过程，都是在实验室跑来跑去的抢时间的，呵呵

wolfrog · 发表于 2013-7-2 15:43:19

samly0 发表于 2013-7-2 15:13

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我们从杀鼠到铺板就2-3个小时呀，原代细胞体外操作的时间越短活性越好，操作步骤上应该没有啥太大的区别 ...

嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细胞浓度只有1×10E6cells/ml，从没用过这么高的浓度。
我是不是应该增加细胞浓度以防CFSE对细胞活性的影响？

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