最近也在做CFSE检测小鼠脾淋巴细胞增殖，请大家帮忙分析

niwanmao · 发表于 2013-7-2 15:54:39

wolfrog 发表于 2013-7-2 15:43

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嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细 ...

细胞多一点，可以抱团取暖：）

wolfrog · 发表于 2013-7-2 16:00:34

niwanmao 发表于 2013-7-2 15:54

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细胞多一点，可以抱团取暖：）

哈哈，那倒是，看到有的帖子里也说到细胞多可以承受更高的CFSE浓度。但是5×10E7细胞是不是有点多，大半个脾呢……大家都是用这么多吗？

niwanmao · 发表于 2013-7-2 16:07:54

wolfrog 发表于 2013-7-2 15:43

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嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细 ...

至少5×10E6/ml还是要的：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2370-1-1.html

samly0 · 发表于 2013-7-2 16:13:27

wolfrog 发表于 2013-7-2 15:43

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嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细 ...

嗯，这也是个办法

samly0 · 发表于 2013-7-2 16:21:54

samly0 发表于 2013-7-2 16:13

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嗯，这也是个办法

每个实验室的条件不一样，这个最好先自己摸摸浓度和孵育时间，因为细胞浓度孵育浓度和时间我都尽量减到最低，所以也怕减过头了导致染色不完全，因此我每次铺板前都会留点细胞上流式看看染色完不完全，也就是看CFSE阳性细胞是不是百分百。可以先做个台盼兰看下活力再铺板加刺激，免得浪费抗体和耗材，一般第二天镜下就能看到明显的活化细胞

wolfrog · 发表于 2013-7-2 16:38:11

samly0 发表于 2013-7-2 16:21

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每个实验室的条件不一样，这个最好先自己摸摸浓度和孵育时间，因为细胞浓度孵育浓度和时间我都尽量减到最 ...

嗯，非常感谢～！你们刺激活化用的是什么方法，多大浓度呢？

samly0 · 发表于 2013-7-3 09:39:49

wolfrog 发表于 2013-7-2 16:38

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嗯，非常感谢～！你们刺激活化用的是什么方法，多大浓度呢？

IL-2 （终浓度100IU/ml)，anti-CD3 antibody（终浓度2ug/ml）和anti-CD28 antibody（终浓度2ug/ml），Biolegend公司。

pushiming77 · 发表于 2013-7-3 21:05:43

以前一个老师结婚，出差了。昨天才回来。
我这个实验也做的很纠结，不过明天又要再次试验这个实验，
对了，我对抗体0.25，0.5，1.0，2.0，4.0进行实验过，看以看到明显的增殖。细胞长的一堆一堆的。这四个梯度基本情况是一样的。所以我觉得不是抗体浓度的问题。我现在都用0.5这个浓度了。
我做这个实验虽然一直没有成功。我觉得可能是CFSE在染色的时候出问题，还不是实验其它部分的问题。得到的增殖细胞可以在10%以上。有时候会更好。
你做实验的时问拉的太长了，本来对细胞的活力都有影响的。一般我在2个时左右。
目前我认为我实验的失败可能是每个细胞染色均匀，以致于增殖锋重叠，而看不到增殖峰，明天想在混匀器的条件试一下，希望有好的结果。
还有你的细胞浓度是不是太少了，我用96板，每well都用了100000或200000，你用24板，是不是细胞太少了。
我的电话是15878397470，有机会可以相互电话讨论这个实验。
哎，好纠结呀。

pushiming77 · 发表于 2013-7-3 21:06:51

wolfrog 发表于 2013-7-2 16:00

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哈哈，那倒是，看到有的帖子里也说到细胞多可以承受更高的CFSE浓度。但是5×10E7细胞是不是有点多，大半 ...

是有一点多哈。1X10E7，我可以接受。

wolfrog · 发表于 2013-7-4 09:25:35

pushiming77 发表于 2013-7-3 21:05

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以前一个老师结婚，出差了。昨天才回来。
我这个实验也做的很纠结，不过明天又要再次试验这个实验，
对了， ...

谢谢～！我昨天也重新设计了实验做了一下，杀鼠到铺板终于控制在2h20min。染了5×10E6个细胞，用了2uM和1uM两种浓度，37度孵育了5min.
这次用了48孔板，5×10E5cells/well
也发现了染色不均一的问题，虽然都染上了但峰有些宽，之前一个JOVE的视频就是用涡旋的方法混匀的，下次我想这么试试。
还有孵育的过程中略微摇晃一下也许也会好一些。

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