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流式细胞术疑难解答(二):背景荧光(非特异性染色)高

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发表于 2015-1-29 16:06:06 | 显示全部楼层 |阅读模式

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背景荧光高(即非特异性染色明显)可能是多种因素造成,例如荧光素、抗体、标记方法、仪器、其它试剂或数据分析等。在此,我们对常见的11种原因进行一一解析,让大家能够充分了解背景荧光的来源,从而能够在实验中针对性的去解决。
1HiBgd-img.png


1、自发荧光
不同细胞和组织,以及培养基添加物,都有不同水平的自发荧光。自发荧光主要的来源包括NADH、核黄素、黄素辅酶分子、多聚甲醛中的伯胺分子交联、某种生物结构(如线粒体、溶酶体等)。粒系细胞特别容易出现自发荧光,因为这些细胞内的蛋白和分子更容易在低波长时被激发(例如紫外、紫光和蓝光),发射波长大约在500~700nm,与一些常见的荧光素(如FITC、PE)重叠。所以对这类细胞应该记得用未染色的空白对照检查一下自发荧光水平。

另外切记,直方图上看不出自发荧光群,只有通过散点图才能看出自发荧光群体并将它圈出,如下图中所示FL-1(GFP)和FL-2散点图查看GFP表达细胞,直方图看到两个峰,但无法区分自发荧光,而散点图则可轻松圈出自发荧光群体(AF)。

2autofluorescenceIMG.png

2、稀释
3dilutionHBGIMG.png

抗体用量是否合适?尽管厂家会有推荐的抗体用量,但要记得使用前进行抗体滴定,以了解最佳用量。优化后的抗体用量可以帮助你最大程度地减少背景荧光并提高信噪比。


3、补偿高
如果两个或更多的荧光素之间发射谱重叠,那么就需要调节补偿以消除相互间的影响。不过,调节补偿前,首先需要电压值调节到合适的值,否则会导致补偿异常增大。例如下图中,BV510™和BV570™之间由于相互渗漏存在补偿,如果BV570™的电压被BV510™的电压明显高,那么会导致补偿过大(下图左侧),如果PMT电压调节到合适值,那么他们的补偿就非常好调了(下图右侧)。


4Compensation.png
所以,有时候你的背景荧光高很可能是由于电压没有调好的问题。

4、代谢活化
5MetabolicActivation.png

背景荧光增高也可能由于代谢活化引起。例如在PMA活化的PBMC中染IL-17A时,从FMO对照中明显看出BV421™通道基线的上升,这可能由多个因素引起,包括自发荧光增高和其它荧光素的渗漏增大引起。

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 楼主| 发表于 2015-6-4 21:37:58 | 显示全部楼层
zhang4083 发表于 2015-6-4 20:25
第2点的图形,没有看明白。

例如下图中,BV510™和BV570™之间由于相互渗漏存在补偿,如果BV570™的电压比 ...

这个其实你平时做免疫分型可以有很深的体会的,如果电压合适,只需要一点点补偿就能够调节到位,如果两个通道电压不合适,某个通道电压过低,就会造成补偿怎么调都不行。

至于文中的下图左侧、右侧就是那两张表,对应不同的电压和补偿值。
发表于 2015-1-29 20:40:46 | 显示全部楼层
好贴 马克之 谢谢倪老师
发表于 2015-2-2 09:57:35 | 显示全部楼层
学习留档,谢谢倪老师!
发表于 2015-2-2 16:48:10 | 显示全部楼层
谢谢,好东西!
发表于 2015-2-3 09:01:31 | 显示全部楼层
学习了,涨姿势了,谢谢!
发表于 2015-5-28 09:10:18 | 显示全部楼层
倪老师,有不有背景荧光降低的情况?
发表于 2015-6-3 15:17:40 | 显示全部楼层
这个好帖子。
发表于 2015-6-4 16:13:48 | 显示全部楼层
学习了,谢谢分享。
发表于 2015-6-4 20:25:19 | 显示全部楼层
第2点的图形,没有看明白。

例如下图中,BV510™和BV570™之间由于相互渗漏存在补偿,如果BV570™的电压比BV510™的电压明显高,那么会导致补偿过大(下图左侧,就这里没有看明白),如果PMT电压调节到合适值,那么他们的补偿就非常好调了(下图右侧,还有这里)。

说白了,就是图三下面的图,关于补偿的没有看明白。


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