如何才能每次都搭配出正确的抗体方案？

niwanmao

搭配正确的抗体方案，就象拼图一样，两块拼图之间就象抗原与流式细胞仪检测滤光片之间的搭配似的，搭的好，天衣无缝，搭的不好，会让人抓狂发疯。

要解决流式抗体方案搭配“这幅拼图”，只需要按照以下几步就能简单解决：

第1步：提出生物学设想
任何方案都是为了解决实验所要解决的生物学设想，基于这个设想，我们明白自己需要检测什么样的细胞群，想从数据中获取哪些信息。在实验开始前，根据细胞表达水平和标记在生物学设想中的重要程度，对抗体进行排序。
例如，检测T细胞活化，我们可以这么考虑，CD3在T细胞中高表达，对于第一步设门比较重要，而CD86表达弱，只有细胞活化后才出现，对我们的生物学设想和实验结果非常重要。


第2步：对荧光素进行排序
可根据荧光素亮度对它们进行排序，可以参考一些荧光素亮度排行的图谱，例如http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2163-1-1.html或http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2367-1-1.html。
根据荧光素亮度和抗原在细胞上的表达水平，对抗原和荧光素进行配对，弱表达抗原可以搭配强的荧光素。（注：不过，我们还需要考虑其实际应用时的SI以及通道的灵敏度，见下一步）。

第3步：了解你所使用的仪器
设计抗体方案前，需要了解你的流式细胞仪，需要特别注意哪个通道（即哪个滤光片）检测灵敏度最高，而不能把灵敏度和荧光素强度等同，有时候，如果通道的误差小，可以考虑采用不是很强的荧光素。



以上是4色流式细胞仪上荧光素渗漏到各个检测通道的计算值Excel表（405nm、488nm、532nm、633nm），横向总和代表某个通道接收方案中各种荧光素渗漏的误差总和，纵向总和代表某个荧光素渗漏到各个通道的误差总和。这些误差的计算公式请参见：Nguyen et al. (2013) Cytometry A 83A:306-315（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3678531/）

通过上面的分析，我们就能够确定用哪种荧光素可以取得最佳的灵敏度。

第4步：使用方案创建工具
除了从厂家目录、Google搜索产品外，还有几个现成的工具帮助你搭配方案，如Chromocyte、Fluorish、Fluorofinder，但国内的网络环境，可能导致这些工具不一定用得好。

第5步：优化方案
以上创建的方案还需要进行优化和验证，合适的抗体滴定、正确的电压、优化的染色方法以减少非特异性结合等等，这些优化措施都是方案优化过程中长期性、非常关键的步骤。

第6步：采用OMIP
OMIP是优化多色免疫表型方案（Optimized Multicolor Immunophenotyping Panel）的书写，是同行评议的优化流式方案，OMIP方案的好处就是可以拿来就用，包括了抗体搭配、荧光素选择和分析模板，流式中文网翻译了16篇OMIP，参见http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... ion=view&ctid=6，接下来会持续翻译更新。

当然，平时会碰到不少没有OMIP的抗体方案，如果你要设计新的方案，记得遵守上述步骤，并且别忘了来流式中文网（http://www.flowcyto.cn）讨论，别把时间和资源浪费在不正确的抗体方案设计上。