『教你一招』脑脊液、细针穿刺标本的最佳处理方法

niwanmao

脑脊液、细针穿刺标本，这两类标本是临床流式检测时最难的，一是因为细胞量少，另一方面是在处理时很容易被破坏。碰到混浊的脑脊液还好，无论怎么离心都还是可以获取到大量的细胞，但对于澄清的脑脊液标本和所有的细针穿刺标本，细胞能保留多少就很难说了，我们平时做脑脊液标本也经常会看到下图这样，很难圈到状态好的细胞：


细胞保存液专门为了流式标本的保存而生，之前我们测试过外周血、骨髓、淋巴结等细胞量多的标本（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5312-1-1.html），那么对于少细胞标本处理过程中的细胞保留情况是否也比较好呢？



经过最近一周的摸索，检测了几例脑脊液和细针穿刺标本，尽管因为标本量问题没有办法做更科学的对比，但从最终获取到的有效细胞数以及荧光强度上看，用细胞保存液确实取到了颇为不错的成效，现将protocol分享给大家：


［脑脊液标本］
1、收到脑脊液标本后，以保存液：标本＝1：5的比例在脑脊液标本中加入细胞保存液。颠倒数次，充分混匀，静置2分钟，也可以保存过夜。
2、离心后，倾倒试管去上清，快速回转正位，这一步一定要快，既要去掉上清，又不能让离心后的细胞团块丢失，一般操作后可留下50～100ul细胞悬液，此时可直接加入要检测的抗体，室温避光孵育15分钟。
3、加入2ml PBS，洗涤1次，离心去上清后，以200ul PBS重悬（或更少体积重悬，看你的机器获取速度而定），上机获取。

下面是今天处理的一例脑脊液标本，收到后对着光线一看，天哪，跟水一样澄清，当时就很没有信心，然而，令人惊喜的是，通过上述步骤处理后，还能够保留2万多个细胞，并且在其中检测到T淋巴母细胞的残留病灶，十分漂亮。

［细针穿刺标本］
1、收到细针穿刺标本后，取出丝线状穿刺组织，置于培养皿或其它小容器中（最好圆底，越小越好，我个人是用一次性吸管剪出手捏的圆头部分作为处理装置），加入200～300ul保存液。用镊子和剪刀反复剪碎，一定要有耐心，直到剪成颗粒非常细，然后用一次性吸管反复快速吹打10次，用300目筛网转移到流式管中。
2、将临床送检细针穿刺标本时标本杯中剩余的生理盐水也收集到流式管，也加入总体积1/10的保存液，吹打均匀，接着和第1步中处理得到的标本一起离心，去上清，集中到一根流式管中，再加入总体积1/5的细胞保存液。这一步开始，可直接进行染色上机，也可以保存过夜。
3、离心后，倾倒试管去上清，快速回转正位，这一步一定要快，既要去掉上清，又不能让离心后的细胞团块丢失，一般操作后可留下50～100ul细胞悬液，此时可直接加入要检测的抗体，室温避光孵育15分钟。
4、加入2ml PBS，洗涤1次，离心去上清后，以200ul PBS重悬（或更少体积重悬，看你的机器获取速度而定），上机获取。


下面这个标本是从其它医院送检的会诊标本，只有不到1cm的丝线状细针穿刺组织（睾丸），而且他们还需要大部分细胞拿回去做科研和基因检测，非常珍贵。看着这一点点标本，我只能咬咬牙按照上面几步，最后只获得500ul只有悬液，我只取了其中50ul标本进行检测，又一次让我喜出望外，这1/10的标本中，就有1万8千多细胞，而且都是活力好、染色好的细胞。



经过本周这几次的摸索，我初步定下来了迄今为止我个人认为脑脊液、细针穿刺标本的最佳处理方法，细胞得率高，而且活力保留好（细针穿刺标本处理上比之前用那些研磨机器好得多，研磨机器对于大标本还可以，但对如此少量的细针穿刺标本，很难磨好），关键是处理完的细胞悬液还可以保存过夜，最长可保留多久，等下次再遇到量比较多的标本再测试看看。

如果您也想试试，可申请试用装看看（尽管试用装是试管包装，可能不太适合，但是里面的液体是一样的）：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5289-1-1.html

niwanmao

微信公众平台有站友问到：

真有那么多吗？貌似临床上很少能碰到那么多的！如果那么多细胞平常的方法就可以收集到！这样的步骤和脑脊液常规做过对照没

我的回答是：

之前不用这个方法，基本上有效细胞信号只有1000左右。我平时都靠目测，拿到标本对光线一照，澄清如水就说明很少，刚才为了回答你这个问题，特地问了主管医生，对方说脑脊液常规只有80个/ul，所以总共大概标本中只有3万多个细胞，最终我们收获了23600多，这个得率是很不错了。

guo348473806

倪老师，你好，脑脊液标本可以先离心，再加保存液吗，因为脑脊液上清还要做其他实验，如果全倒掉太可惜了，不知道效果会不会有很大影响？

niwanmao

guo348473806 发表于 2019-11-3 09:46
倪老师，你好，脑脊液标本可以先离心，再加保存液吗，因为脑脊液上清还要做其他实验，如果全倒掉太可惜了， ...

先取点上清，剩余的按照样本：保存液＝8：1的比例直接加保存液，然后充分混匀，不建议离心后再加。