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如何将中性粒细胞和PMN-MDSCs分开?

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 楼主| 发表于 2022-1-6 16:50:18 | 显示全部楼层 |阅读模式

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中性粒细胞的发育
中性粒细胞是最多的一种粒细胞,在骨髓 (BM) 经过以下阶段发育而来:髓系祖细胞、粒细胞-单核细胞共同祖细胞、粒系祖细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、杆状核中性粒细胞,最后是分叶核中性粒细胞。中性粒细胞成熟过程中形成的颗粒是抗微生物因子和酶的储存库,如髓过氧化物酶 (MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE)、防御素、抗菌肽和基质金属蛋白酶 (MMP),可保护宿主免受感染并促进炎症消退。BM中产生的中性粒细胞到外周血短暂循环后,便迁移到组织中,这种迁移由活化的内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和各种微生物在感染时释放的趋化因子调节。凋亡的中性粒细胞主要由常驻组织巨噬细胞清除。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF、CSF3)已被确定为中性粒细胞发育的关键调节因子。 G-CSF受体在粒细胞从早期祖细胞分化为成熟中性粒细胞的过程中表达。然而,粒细胞生成并不是绝对需要 G-CSF,因为 G-CSF 缺陷小鼠还是能生成大约25%的中性粒细胞,并且是完全分化的中性粒细胞。其他因素,如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF、CSF2)、白细胞介素 6(IL-6)和 c-kit 配体,与中性粒细胞发育有关。中性粒细胞在 BM 中的保留很大程度上取决于趋化因子受体CXCR4。 CXCR4的缺失会导致中性粒细胞从 BM 释放到循环中。相比之下,趋化因子受体 CXCR2 通过其配体 CXCL1/CXCL2 发挥作用,促进中性粒细胞从 BM 释放。 G-CSF通过下调CXCR4及其配体 CXCL12 的表达,从而增强CXCR2/CXCL2 介导的中性粒细胞动员,使其进入循环。

如何区分PMN-MDSCs和中性粒细胞?
中性粒细胞和 PMN-MDSC 具有相同的起源并遵循上述相同的分化途径,在表型上也相似。在小鼠中,它们都具有 CD11b+Ly6G+Ly6Clow 的表型;在人类中,它们都被定义为 CD14-CD11b+CD15+(CD66b+) 。

由于表型具备高度相似性,故无法单纯通过表型区分两者。

目前标准的方法是,使用 1.077g/mL Ficoll通过梯度离心分离出**人中性粒细胞**和 **PMN-MDSC**。中性粒细胞是高密度细胞,而PMN-MDSC富含低密度单个核细胞部分。尽管密度梯度离心在临床研究中被大量用于检测PMN-MDSC,但该方法存在一些不足之处,就是「低密度部分」中的许多细胞也可以由活化的中性粒细胞,而不全是PMN-MDSC。此外,有一些 PMN-MDSC 也可以在高密度部分。由于这两个原因,我们在研究病理条件下的PMN-MDSC时,容易会出现比例上的偏差,另外需引起我们重视的是,一部分 PMN-MDSC 也可能受到外周血样本处理不当的影响(如长期储存或冷冻),因此,研究时,应尽量减少 PMN-MDSC的样本处理和流式细胞术分析前处理的时间。

尽管中性粒细胞和PMN-MDSC表型相似,但还是有研究报道认为两者之间存在某些表面标志物的表达水平差异,例如Youn等人认为**小鼠PMN-MDSC**比中性粒细胞表达更高水平的 CD115 和 CD244(Youn JI, et al. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Leukoc Biol. 2012;91(1):167–81.)。 然而,由于 PMN-MDSC 的异质性,这些标记对于定义这些细胞群的价值有限。 Condamine等人认为**人PMN-MDSC**上高度表达的凝集素型氧化LDL受体1(LOX-1),并证明该标记可以将这些细胞与多种癌症患者的外周血和肿瘤组织中的中性粒细胞区分开来(Condamine T, et al. Lectin-type oxidized LDL receptor-1 distinguishes population of human polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells in cancer patients. Sci Immunol. 2016;1(2))。 LOX-1可能可以作为识别癌症患者PMN-MDSC的标志物,不过还需要更多的研究来证实。

PMN-MDSC具有免疫抑制作用,除了直接抑制 T 细胞功能外,PMN-MDSC 还能抑制其他髓系细胞和NK细胞的活性和功能。 相反的是,中性粒细胞通常参与其他髓系和淋巴细胞的活化、调节和效应功能。

PMN-MDSC 和中性粒细胞具有不同的分子和生化特征。

小鼠 MDSC 的定量蛋白质组学确定这些细胞构成了一个独特的髓细胞群,具备特殊的“激酶特征”和明确定义的“相互作用组”(名词解释,相互作用组(interactome):在细胞、组织、器官或全部的有机体的完全的微分子相互作用(蛋白质-蛋白质,DNA-蛋白质,RNA-蛋白质))。

全转录组分析揭示了来自荷瘤小鼠的 PMN-MDSC 和来自无肿瘤小鼠的中性粒细胞之间的明显差异,PMN-MDSC与细胞周期、自噬、G蛋白信号传导和CREB通路相关的基因表达较高,而中性粒细胞与 NF-κB 信号传导和淋巴毒素-β 受体信号传导相关的基因表达升高。进一步的分析证实,中性粒细胞的磷酸化c-Jun、p38、JNK 和 ERK1/2基础水平明显高于 PMN-MDSC。与 PMN-MDSC 相比,活化的中性粒细胞表达TNF-α的水平显著更高。在头颈癌患者中,Brandau等人确定了一个 PMN-MDSC 亚群,与成熟的中性粒细胞相比,LPS诱导的 IL-8 释放减少。

一些编码趋化因子及其与迁移相关的受体的基因在 PMN-MDSC 和中性粒细胞中存在差异表达,例如,与 PMN-MDSC 相比,中性粒细胞的 CXCL4 和 CXCL12 水平升高,而 CCL3、CCL4 和 CXCL2 的表达降低。来自癌症患者的 PMN-MDSC 对肿瘤条件培养基的趋化性显著降低,趋化因子受体 CXCR1 和 CXCR2 的表达降低,这是中性粒细胞从血流中外渗和随后的组织浸润所必需的。

许多信号通路与 PMN-MDSC 发育和功能的调节有关。 STAT3 的激活被证明是 MDSC 积累的原因。因此,该转录因子的上调被认为是人类和小鼠中 PMN-MDSC 的标志。干扰素相关因子 (IRF)-8(IRF 家族的成员)的下调与小鼠中的 PMN-MDSC 扩增密切相关。有报道称,肿瘤生长伴随着 IRF8low 粒细胞祖细胞的选择性扩增,其分化为 PMN-MDSC 的能力增强。 C/EBPβ 转录因子(碱性区域亮氨酸拉链转录因子家族的成员)的上调与 MDSC 扩增有关。迄今为止,与PMN-MDSC对T淋巴细胞抑制活性有关的最突出因素包括精氨酸酶、活性氧 (ROS) 和前列腺素E2 (PGE2) 。肿瘤中氧化磷酸化和糖酵解的变化也与 MDSC 功能有关。在体外模型中,糖酵解速率的增加与 MDSC中精氨酸酶1(ARG1)活性的增加同时发生。肿瘤浸润性 MDSC 已被证明优先利用脂肪酸 β 氧化作为主要能量来源。

内质网 (ER) 应激反应最近已成为参与调节 MDSC 病理激活的重要机制,对其功能至关重要。来自荷瘤小鼠和癌症患者的 MDSC 表现出比来自无肿瘤宿主的中性粒细胞和单核细胞显著增强的 ER 应激反应。 ER应激的实验诱导增强了肿瘤浸润性MDSC的免疫抑制能力;这种效应是通过 ARG1、NOS2 和 NOX2 表达的上调介导的。从 C/EBP 同源蛋白 (CHOP) 缺陷小鼠中建立的肿瘤中分离的 MDSC 显示磷酸化 STAT3 表达降低,IL-6 和ARG1的产生减少,导致这些细胞的免疫抑制活性降低。与 LOX-1- 中性粒细胞相比,在人 LOX-1+ PMN-MDSC 中观察到剪接的 X-box 结合蛋白 1 (sXBP1) 增加,这是另一条内质网应激反应途径的成员。此外,从健康供体中分离出的中性粒细胞中内质网应激的诱导将它们转化为有效的免疫抑制细胞。 MDSC 介导的免疫抑制的其他几种机制包括调节性 T 细胞的激活、免疫抑制性细胞因子转化生长因子 β (TGF-β) 和 IL-10 的表达增加、半胱氨酸截留以及T细胞对L-选择素的表达降低。

信源:Zhou, Jie et al. “Neutrophils and PMN-MDSC: Their biological role and interaction with stromal cells.” Seminars in immunology vol. 35 (2018): 19-28. doi:10.1016/j.smim.2017.12.004
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发表于 2022-1-12 09:19:35 | 显示全部楼层
所以说,通过流式标记的方法是无法将两者分开的吗?
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 楼主| 发表于 2022-1-12 13:38:26 | 显示全部楼层
酱酱的大猪猪 发表于 2022-1-12 09:19
所以说,通过流式标记的方法是无法将两者分开的吗?

单纯流式,人的可以用LOX1,但最好结合功能。
小鼠的话,可能只能通过密度分群+功能区分。
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发表于 2022-1-12 16:46:18 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-1-12 13:38
单纯流式,人的可以用LOX1,但最好结合功能。
小鼠的话,可能只能通过密度分群+功能区分。 ...

可惜是我的是小鼠的呜呜呜,谢谢倪老师!十分感谢您的答疑解惑!
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发表于 2022-2-24 11:47:20 | 显示全部楼层
倪老师,我看师兄之前一篇文章用了Gr-1将MDSC和中性粒细胞区分,请问这样可以吗?谢谢倪老师!
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 楼主| 发表于 2022-2-24 14:42:52 | 显示全部楼层
stevehan 发表于 2022-2-24 11:47
倪老师,我看师兄之前一篇文章用了Gr-1将MDSC和中性粒细胞区分,请问这样可以吗?谢谢倪老师! ...

Ficoll分出来之后,再用这个标记是可以的,但是没分之前,是不合适的。
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