人treg细胞流式检测遇到问题

彩虹xy

我在做用流式检测药物刺激人CD4+T细胞后treg细胞的比例，方法是用CD4磁珠分选人外周血细胞，然后加药物刺激培养，用流式检测treg细胞比例，用的是BD公司的TREG细胞流式抗体试剂盒，流式机子也是BD公司的，在做流式时遇到以下问题：
阴性管，CD4单标，CD25单标，foxp3单标，样本1，样本2（样本是三标）
1，上机检测时，用阴性管调好电压，圈定细胞后，CD4，CD25单标管细胞位置跟阴性管一样是正常的，但从foxp3单标和样本管细胞位置就发生了很大改变，出现了虽然读过的细胞很多，但因为位置发生改变，圈定中的细胞却很少
2，因为我用的是磁珠分选后的CD4细胞，CD4单标基本都染上了，CD25单标有10%左右的阳性，但foxp3阳性率异常高，阳性率有达80%左右，非常奇怪，
做了两次了foxp3的表达都离奇的高，不知道是什么原因，
以下是我染色步骤，除了细胞用的不是PBMC而是磁珠分选后的CD4细胞，悬浮细胞和洗涤用的是自己配的PBS缓冲液，其他都是按照说明书中的操作来的，不知大家在做treg细胞流式检测时有没有相同的经历，希望可以得到大家的帮助。

1. Bring the buffers to room temperature before use. Prepare working solutions of the Human FoxP3 Buffer Set (Cat. No. 560098)
as described in the section above (Preparation of Buffers Before Use).
2. Prepare human PBMC. Dilute the cells with BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS) (Cat. No. 554656) to 1X10^7 cells/mL.
3. Pipette appropriate amount of surface staining reagent to bottom of each 12 x 75 mm tube.
4. Add 100 μL of cells per tube, vortex, incubate for 20 minutes at room temperature, protected from light.
5. Add 2 mL of Stain buffer (FBS)* to wash. Centrifuge 250 x g for 10 minutes, and remove wash buffer.
6. To fix the cells, gently re-suspend pellet in residual volume of wash buffer and then add 2 mL of 1x Human FoxP3 Buffer A. Vortex.
Incubate for 10 minutes at room temperature, protected from light.
7. Centrifuge 500 x g for 5 minutes, and remove fixative. Caution: the pellet is buoyant.
8. To wash cells, re-suspend each pellet in 2ml of Stain Buffer (FBS)*, and centrifuge 500 x g for 5 minutes. Remove wash buffer.
9. To permeabilize the cells, gently re-suspend pellet in residual volume of wash buffer and then add 0.5 mL of 1X working solution
Human FoxP3 Buffer C to each tube. Vortex. Incubate for 30 minutes at room temperature, protected from light.
10. To wash cells, add 2 mL of BD Pharmingen Stain Buffer (FBS)* to each tube, centrifuge 500 x g for 5 minutes at room temperature.
Remove buffer and repeat wash step. Remove buffer.
11. Add conjugated FoxP3 antibody at appropriate concentrations to re-suspend the pellet. Gently shake or vortex.
12. Incubate for 30 minutes in the dark at room temperature.
13. Repeat wash as in Step 10.
14. Resuspend in wash buffer and analyze immediately. Acquire at least 15,000 to 25,000 CD4 positive lymphocytes.

niwanmao

你按照他们试剂盒的说明书做，一般来说问题不大，关键应该在于分析时的设门。
建议你把原始数据文件传上来，我们看看。

彩虹xy

这是我的原始数据，tube1,2,3管分别是阴性管、CD4单标管、CD25单标，
tube5,6,7,8,9是我的样本管三染的，本来tube4是foxp3单染的，但是数据丢失了，染料分别是：CD4-FITC、CD25-APC、FOXP3-PE, 结果中foxp3表达太高了，而且染了foxp3的，不管是单标foxp3还是三染的样本管，相对于阴性管和只染了表面抗原的，细胞位置都发生了偏移，不知道什么原因，希望大家可以帮我分析下，感激不尽。

fernazy

foxp3单标细胞移动是因为你破膜了呀 细胞形态发生变化 是很正常的

彩虹xy

可是我要根据哪一管来调电压，圈定细胞呢，我在阴性管中调好电压，圈定了细胞，到染了foxp3管中圈好的门中的细胞就很少了，计数都跟困难

fernazy

你有没有做同型对照管？

fernazy

还有我建议你CD4单阳和CD25单阳管虽然不需要破膜固定，但是个人第一次调电压和补偿的时候也和染了FOXP3的样本管一样进行破膜固定。

彩虹xy

没有做，只做了阴性管，三种抗体的单标管，再就是样本管了

fernazy

按照标准流程来说，CD25和FOXP3都是弱表达，你是应该根据单阳管调电压，同型对照来圈定CD25和foxp3的阳性阴性界限，多色管来调补偿，最后再上样本管

niwanmao

彩虹xy 发表于 2014-5-28 21:20
没有做，只做了阴性管，三种抗体的单标管，再就是样本管了

我建议：
可根据内部不表达foxP3的那群细胞作为阴性内对照，例如我圈了CD4＋CD25－那群细胞作为阴性内对照，按照曲线延伸设置好marker。

内对照（阴性）

然后，以该marker为标准，不动，再圈CD4＋CD25＋那群细胞，看其foxP3阳性率。