贴壁细胞PI（碘化丙啶）染色操作视频

niwanmao

贴壁细胞PI（碘化丙啶）染色的操作视频，从细胞的消化到染色，每个细节都完整详细地呈现在我们眼前。
视频转自abnova公司。

视频截图10幅：
1、吸掉培养基后，用PBS洗涤


2、加入胰酶


3、消化完毕，加入PBS洗下细胞


4、离心


5、去上清


6、0.3ml PBS重悬


7、加入0.7ml纯乙醇（最终乙醇浓度70％），－20℃作用20分钟


8、去除乙醇


9、加入500ul RNase（浓度200ug/ml），作用30分钟


10、加入500ul PI（终浓度50ug/ml）孵育30分钟（避光）。最后上机。




视频观赏见下（通过实名认证的站友可见）：

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椴树

niwanmao 发表于 2015-6-26 21:19
RFP没用过，查了下发射波长是580nm，而PI是620nm，可能在beckman仪器上还是可以调节的，BD可能比较困难。 ...

老师，我已经解决了，因为我只是转染了RFP进去细胞，在分析周期时并不需要分析RFP，所以我用乙醇固定24h后，分别加PI和不加PI，发现不加的话PI是检测不到信号的，RFP应该如你另一篇帖子说的，荧光蛋白溶出细胞外了（上回转了GFP，检测周期结果也测不到GFP，本来不知道怎么回事，现在知道了应该也是溶出去了）。但是在查乙醇固定的原理，没有找到，如果是为了打洞的话，染液中不是加入了Triton了么？想知道乙醇固定的原理，为什么乙醇固定就会溶出细胞，甲醛固定就不会。

resurgam

学习了。谢谢！

PeteM

弱弱的问，这个PI染色目的是啥实验？

niwanmao

PeteM 发表于 2015-5-6 10:30
弱弱的问，这个PI染色目的是啥实验？

检测细胞周期

PeteM

niwanmao 发表于 2015-5-6 10:32
检测细胞周期

老师，谢谢您的回答，我同学最近做了一个实验需要染活死细胞，就染了PI 15分钟然后洗掉上机，发现PI 通道 unstained 的细胞 直方图 与染了PI的直方图 都只有一个 峰，只是染 PI 的 直方图 PI 峰 相对 与 unstained 的峰 向前 了一些，这是怎么回事？非常感谢您的回答

niwanmao

PeteM 发表于 2015-6-23 15:28
老师，谢谢您的回答，我同学最近做了一个实验需要染活死细胞，就染了PI 15分钟然后洗掉上机，发现PI 通道 ...

染死活细胞的话，PI浓度要低，并且在上机前两三分钟染，染完直接上机，不能洗涤。

PS：下次建议开新帖提问，谢谢。

椴树

niwanmao 发表于 2015-6-23 17:38
染死活细胞的话，PI浓度要低，并且在上机前两三分钟染，染完直接上机，不能洗涤。

PS：下次建议开新帖提 ...

老师，请问我的细胞本身表达GFP和RFP，我想检测细胞周期，可以用PI么？有什么解决方案么？

niwanmao

椴树 发表于 2015-6-26 15:10
老师，请问我的细胞本身表达GFP和RFP，我想检测细胞周期，可以用PI么？有什么解决方案么？ ...

RFP没用过，查了下发射波长是580nm，而PI是620nm，可能在beckman仪器上还是可以调节的，BD可能比较困难。

如果有紫外激光，可以试试DAPI或者Hoechst染料看看；如果没有，可以试试DRAQ5

sendohyozen

老师您好!弱问一下,这实验我也马上要做了,以前做过峰形很难看,看视频PI这是不用洗直接上机吗?RNase也不用洗?
我以前洗着洗着 细胞都没了,好像固定后的细胞不太好离心下来的样子.....