流式和肾癌的故事

niwanmao

尽管流式应用不少，但临床上基本上只做基本的淋巴细胞亚群和血液肿瘤（白血病/淋巴瘤）免疫分型，但我一直坚信，流式的用途不应该只有现在这点范围。

这不，2016年9月，Ciputra Adijaya Hartana等人在线发表在《British Journal of Cancer》上的文章《Detection of micrometastases by flow cytometry in sentinel lymph nodes from patients with renal tumours》，利用流式细胞术检测肾癌患者淋巴结的微小转移灶，就使我们感受到了流式的新威力。

肾癌，是世界上第14位常见癌症，2008年全球发病率273.518/10万。肾癌的淋巴结转移显著影响肿瘤的预后，目前的主要检测方法是对淋巴结活检，切片进行HE染色，然后看片子，但这个步骤繁琐费时，而且容易遗漏掉微小转移病灶，既往发现有19.4％的淋巴结HE染色镜检会发生漏诊。 Weaver等人在2003年介绍了一种免疫组织化学染色标记多种细胞角蛋白并利用自动计算机辅助图像分析的方法，使得淋巴结微小转移灶灵敏度得到了极大提升，但这种方法仍然很费时，而且需要大量淋巴结切片以防止漏检。

现在分子生物学的RT-PCR尽管可高灵敏性检测低转录本mRNA，但一方面mRNA易降解，另一方面容易污染。

文中，作用利用流式细胞术检测了5例肾癌患者，15份淋巴结组织细胞表面的CA9（碳酸酐酶9）、Cadherin 6（钙粘蛋白6）以及细胞内的CK18（细胞角蛋白18），结果如下。

1、检测三种肾癌细胞株用正常人PBMC稀释后三个浓度梯度的CA9、Cadherin 6和CK18，下面的结果依次是RCC4、CAK16和ACHN3细胞株。可见CK18这个胞内标记最稳定。




2、对用PBMC稀释后的肾癌细胞株检测8小时稳定性，发现8小时后检测，CV值基本上控制在10％以内，只有CA9低浓度在16％。




3、最后来正式的了，5名患者，15份淋巴结的检测结果。
部分流式图如下：



所有检测结果统计如下表（nSN＝非哨兵淋巴结，SN＝哨兵淋巴结），发现一个很有意思的现象，这篇文章作者用的是检测值－同型对照值＝最终结果，如果为负值则计算为0。这种方法以前在论坛内也有站友提问过，我以前说过这种计算方式在ELISA等方法中很常用，但流式实在不建议这么计算，然而，在正式杂志中，我却依然看到了这种方法，尽管它是非流式专业杂志。


5名患者检测结果汇总，可见其中4例均存在一个或多个病灶阳性，只有第5例所有淋巴结组织均阴性。



整体看下来，这篇文章还是存在不少缺陷，文章最后作者自己也承认，首先采用了单标方法，所以灵敏性和特异性不够，尤其是有些同型对照荧光偏高；其次尽管这5例患者与HE染色存在绝对优势，但后续还需要更多病例，还需要和金标准免疫组化进行大队列对比；最后，研究并没有与患者的无复发生存时间（RFS）、总体生存时间（OS）等相关联。 而流式中文网觉得，其实从白血病的MRD检测经验来看，检测获取的细胞数、多色标记方法、分析方法均有待改进。不过尽管存在众多不足，但不愧是流式在其它专科疾病、肿瘤上的一个探索，值得我们关注。

－－－插几句话－－－
文中作者提到用酶法容易导致一些细胞表面标记降解，表达下降，这个我们有经验，其实可以通过有效的物理解离方法配合良好的细胞保存液一起避免这个弊端。
细胞保存液试用装申请：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5289-1-1.html
细胞保存液在组织标本中的使用方法：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5331-1-1.html
有效的物理解离方法，就是〖超级研磨过滤器〗（已申请专利），既是过滤所有流式标本的好玩意儿，也是研磨组织的新型武器，经亲自试用3D打印模型，方便易用而且组织利用率高，配合细胞保存液使用，任何组织都不愁。正式产品会在2017年初与大家见面，你猜多少钱一个？

与流式管完美贴合



开始研磨，边用镊子夹住组织磨边滴细胞保存液



两分钟收工


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