教你一招：如何设置实验中的对照？

niwanmao

流式实验中会用到各种各样的对照，但是大家可能会经常搞不清楚需要用什么对照，空白？单染？同型？还有不少新手没见过的FMO？为此，我们从metroflow翻译了一篇专业博文，供大家参考。

一般流式实验所需的对照和设置这些对照的目的如下：

1) 单染 – 用于设置目的细胞的补偿

你可以使用任何种类的细胞设置单染，但需遵循一个原则：用于单染的细胞阳性群体和阴性群体（如PE＋和PE－）必须具备相同的自发荧光水平。

使用什么试剂？

任何试剂都可以用来作为你的单染对照，只要它的荧光标记和你实验所用的抗体标记相同，并且表达强度类似就可以。例如你可以使用CD34 PE代替CD8 PE。

附加说明：

虽然GFP、CSFE、FITC均在FL1通道检测，但并不意味着你可以用相同的补偿来检测它们，因为它们渗漏到其它通道的比例不相同。
串联染料（如PE-cy7、APC-cy7等）是由两种染料串联起来的，因此它们渗漏到其它通道的比例跟制造工艺有关，因此，你不能用其它相同标记的试剂来代替你实验用的试剂来调节补偿。

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viczlc2006

在设置未经药物处理的相同细胞株作为实验对照（阴性对照）时，
有几个疑问
1 一般阴性置信区间设多少？
2 阴性阳性界限稍微左右挪动下，数值都在变，这个对结果影响吗？
3 感觉阴性电压调大一下，阴性的平均荧光强度变化不大，但阳性的变化幅度要大很多，如何把握就认为“阴性调到合适的位置了？”
4 重复实验时，是保持阴性对照占的百分比一致还是保持细胞的自发荧光值相同？

niwanmao

viczlc2006 发表于 2013-5-8 15:52

                               
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在设置未经药物处理的相同细胞株作为实验对照（阴性对照）时，
有几个疑问
1 一般阴性置信区间设多少？

1、阴性区间现在很多文章都没重点讲，一般都在1％以内。
2、你所说的界限稍微左右移动一下数值变动很大，这一般出现在那种表达强度很弱的抗原，对此种情况，首先建议换用荧光强度高的标记，其次，设门时FMO对照设置在1％以内，并且在直方图上在曲线延伸与X轴交叉处（这是我个人经验，欢迎大家讨论）。一般问题不大。
3、你所说的第三种情况我不太理解。
4、重复实验，关键还是用同样组合的FMO作为参照，设门参照第2点，无需关注荧光强度完全相同，但当然也不能相差太远。

20071271

有些表达很弱，怎么圈

niwanmao

20071271 发表于 2013-5-9 10:25

                               
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有些表达很弱，怎么圈

象这种情况，我个人建议还是比较他们之间的geomean值更好，因为你的同型对照并非正态分布，拖尾现象很厉害（可能跟你的细胞状态不佳，分析时未排除死细胞或自发荧光等因素有关），如果比较他们的表达百分比，你就会发现画marker时，右侧曲线与X轴交叉点两者几乎是重叠的，没法分析。

20071271

niwanmao 发表于 2013-5-9 11:12

                               
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象这种情况，我个人建议还是比较他们之间的geomean值更好，因为你的同型对照并非正态分布，拖尾现象很厉 ...

细胞状态还行，我看前辈们做的也是这样。这个Geomean值，是怎么算的，求详解

niwanmao

20071271 发表于 2013-5-9 11:23

                               
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细胞状态还行，我看前辈们做的也是这样。这个Geomean值，是怎么算的，求详解 ...

geomean在分析软件的结果查看时，可以调出来的，不需要你们算的。你们用的是什么软件？

20071271

我们机器是BD的，自带软件，跑下来后。用Flowjo分析，求怎么操作

niwanmao

20071271 发表于 2013-5-9 13:04

                               
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我们机器是BD的，自带软件，跑下来后。用Flowjo分析，求怎么操作

BD的cellquest可以直接在设置窗口就可以打上勾，diva可以在统计窗口点击鼠标右键，选择edit statistics，选择geomean。

flowjo参考下图：

flowjo设置geomean参数显示

20071271

像这种图是不是也是一种圈门，但是数字的意思是？