基于微流控的流式细胞仪对原生质体的功能表征和表型分析

niwanmao

要更好地了解原生质体的表型异质性，需要对许多单个细胞的形态和代谢特征进行全面分析。在单细胞表型分析方面，流式细胞仪已证明其具有高通量定量分析和分离目标生物样品的能力。

然而，传统的流式细胞仪体积庞大、复杂且需要高技能的人员。随着微流控技术的发展，微流控已与流式细胞仪相结合(MFCM)，实现了强大的单细胞聚焦、检测和分选，已在各种生物应用中得到证明 ，包括单细胞 RT-PCR、干细胞筛选、蛋白质分析等。虽然 MFCM 已被证明是医学诊断和动物细胞研究中单细胞操作和分析的强大工具，但在植物细胞特性方面的类似工作仍然远远落后。

天津大学环境科学与工程学院的Xingda Dai等人开发了一种带有荧光传感器的微流控流式细胞仪，为原生质体样品的分析提供了一种简单、直接且具有成本效益的解决方案。原生质体是植物细胞，其中细胞壁已被酶促或机械去除，是生物技术应用（如体细胞杂交和遗传转化）的非常有效的实验模型。原生质体提供了悬浮培养中的多细胞组织和细胞组装体所没有的许多细胞学优势，因此是研究细​​胞过程（如信号转导、细胞壁再生、压力和激素的作用等）的宝贵实验系统。然而，在细胞壁消化后，产生的原生质体是渗透敏感的、脆弱的结构，需要格外小心以保持其完整性。

此外，原生质体的直径通常比哺乳动物细胞大，并且不像动物细胞那样粘附，因此使用流式细胞仪分析原生质体群体需要对仪器配置进行重大更改，并且极难实现稳定的流动。

下图就是文章中所用的微流体流式细胞仪。 (A) 开发平台示意图； (B) 已开发平台的照片； (C) 单个植物细胞通过通道的延时图像； (D) 单个植物细胞双通道荧光检测的实时响应。


       
首先，基于用二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA)染料检测拟南芥叶肉原生质体细胞内活性氧 (ROS) 的变化，研究了 H2O2、温度、紫外线 (UV) 和镉离子等各种外部应激因素对细胞内 ROS 积累的影响。

下图显示的是外源 H2O2 介导的拟南芥原生质体 ROS 含量的变化。        (A) 原生质体的荧光图像，比例尺为 25 µm； (B-D) 分别在 3、6 和 9 小时后由原生质体中的 H2O2 浓度诱导的荧光强度梯度； (E) H2O2 处理时间对原生质体荧光强度的影响。



下图显示的是环境压力下拟南芥原生质体的氧化还原状态。 (A) 原生质体在不同温度下的荧光图像，比例尺为 25 µm； (B) 原生质体在不同温度胁迫下的荧光强度； (C) Cd2+处理的原生质体荧光图像，比例尺为25 µm； (D) Cd2+下原生质体的荧光强度； (E) 紫外处理下原生质体的荧光图像, 比例尺为 25 µm; (F) 紫外线下原生质体的荧光强度



其次，从白色花瓣中分离出的矮牵牛原生质体比从紫色花瓣中分离出的原生质体中观察到更快和更强的氧化爆发，证明了花青素的光保护作用。


第三，使用具有不同内源性生长素的突变体，证明了生长素在原代细胞壁再生过程中的有益作用。此外,UV-B 照射通过增加细胞内生长素水平具有类似的加速作用。


该研究揭示了以前未被充分认识的原生质体群体中的表型变异性，并证明了微流体流式细胞术在评估单细胞水平的植物代谢和生理指标的体内动态方面的优势。

信源：Dai X, Zhang S, Liu S, et al. Functional Characterization and Phenotyping of Protoplasts on a Microfluidics-Based Flow Cytometry. Biosensors (Basel). 2022;12(9):688. Published 2022 Aug 26. doi:10.3390/bios12090688