什么原因导致非特异性抗体结合，如何避免？

niwanmao

作者：Kim Le

什么叫非特异性抗体结合？
非特异性抗体结合就是指细胞表面没有特异性抗体结合靶点，却偏偏和抗体结合上了。

非特异性抗体结合的原因有很多。这里主要讲五个。

1、最常见的原因是抗体过量。当抗体浓度太高时，抗体将与亲和力低得多的靶标结合。
解决方案：通过使用滴定，优化抗体浓度，可以解决此问题。

2、另一个原因是抗体与Fc受体的结合。Fc受体是免疫细胞表面的抗体结合蛋白，例如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞和某些T细胞亚群。大多数商品化抗体都抗体包含Fc片段，或多或少都能与Fc受体结合。为了消除这个问题，可以使用Fc阻断剂（包含一种衍生自免疫球蛋白的重组蛋白），该蛋白将与Fc受体结合并最大程度地减少非特异性结合。有些供应商在其抗体试剂中包含Fc阻断剂，而有些则单独出售。

3、死细胞也可以是细胞成团和非特异性结合的来源。死细胞具有粘性，部分原因是其受损的细胞膜暴露了DNA。在染色方案中加入DNA结合染料（死活染料）（例如7-AAD或PI）可以排除死细胞。对于某些检测（例如CD34 +干细胞计数），此方法是必需的（请参阅CAP检查表FLO.30564）。如果方案中由于荧光搭配问题无法加入死活染料，则可用FSC/SSC散点图中的Viable门，也可以帮助区分活细胞和死细胞（请参见下面的示例）。


4、洗涤和染色缓冲液中缺少蛋白，也容易导致非特异性结合。所有细胞都能不同程度地粘附蛋白。如果洗涤液和染色缓冲液中缺少蛋白，抗体（本身也是一种蛋白）容易非特异性结合细胞并引起高背景荧光。可通过在这些缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）或胎牛血清（FBS），轻松解决此问题。

5、抗体之间也可能发生相互作用，尤其是使用小鼠IgG2抗体时。这种相互作用是由血浆补体蛋白C1q介导的。为了防止这种不必要的关联，可以避免使用IgG2类抗体或在添加抗体之前去除血浆。去除血浆的方法主要有大体积洗涤2~3次，或用NH4Cl裂解液裂解后再进行单次PBS洗涤。


参考文献：
• Capel PJ, van de Winkel JG, van den Herik-Oudijk IE, Verbeek JS. Heterogeneity of human IgG Fc receptors. Immunomethods 1994; 4:25-34.
• Hulspas R, O'Gorman MRG, Wood BL, Gratama JW, Sutherland DR. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry Part B 2009; 76B: 355-364.
• Wood BL, Levin GR. Interactions Between Mouse IgG2 Antibodies Are Common and Mediated by Plasma C1q. Cytometry B Clin Cytom. 2006 Sep 15; 70(5):321-8.
信源：https://www.cytometry.org/web/q_view.php?id=153

Veblen

谢谢老师分享，抗体过量、抗体与Fc受体结合，以及死细胞所造成的非特异性荧光。

immunology1988

再做同型对照的时候，可以将抗体单独加入染色并作为同型对照是吗？ 我看有的会特别去加入特定的同型抗体？我这样的设计会有问题吗？谢谢

niwanmao

immunology1988 发表于 2020-6-28 11:19
再做同型对照的时候，可以将抗体单独加入染色并作为同型对照是吗？ 我看有的会特别去加入特定的同型抗体？ ...

这段话的意思我不太明白。

immunology1988

niwanmao 发表于 2020-6-28 11:26
这段话的意思我不太明白。

染色表面因子或胞内因子的时候，我通常就是将两种或多种抗体因子混合加入。同型对照：单独加入抗体染色。不好意思，老师，前面的表述不清楚。请老师悉心指教！！！

niwanmao

immunology1988 发表于 2020-6-29 09:47
染色表面因子或胞内因子的时候，我通常就是将两种或多种抗体因子混合加入。同型对照：单独加入抗体染色。 ...

你的意思是，做胞内因子的同型对照时，只加入表面标记，而不加入胞内因子抗体？ 那不叫同型对照，如果是只去掉一个胞内因子抗体则叫FMO对照。如果是多个胞内因子抗体都不加，则是「乱对照」

immunology1988

niwanmao 发表于 2020-6-29 10:07
你的意思是，做胞内因子的同型对照时，只加入表面标记，而不加入胞内因子抗体？ 那不叫同型对照，如果是 ...

做胞外表面因子时，通常我是将表面抗体混合后加入样本标记，胞内也是同样。也就是单标和混标吧。不知道我这样对不对！

345641775

老师，2的情况 可以用BSA吗进行特殊细胞Fc段的封闭吗？ 我们实验室并没有采用什么特殊的封闭药，只是在免疫双标染色时加入了Triton和BSA混合液 效果也不错，但是做流式好像没用过封闭液，都是直接做得空白对照和ISO对照，是不是这样就不需要加入封闭液了？还是我们做的不规范？

niwanmao

345641775 发表于 2020-6-29 15:25
老师，2的情况 可以用BSA吗进行特殊细胞Fc段的封闭吗？ 我们实验室并没有采用什么特殊的封闭药，只是在免疫 ...

Triton可以破膜，做表面标记你们那边也加这个吗？
一般如果非特异性染色不明显的，不用BSA也是可以的。

345641775

niwanmao 发表于 2020-6-29 21:07
Triton可以破膜，做表面标记你们那边也加这个吗？
一般如果非特异性染色不明显的，不用BSA也是可以的。 ...

是的，老师说protocol是在他之前在免疫实验室用的，做的是免疫荧光双标的，流式的确实从来没做过封闭。老师说有对照组就可以了。