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「抗体滴定」释疑和注意事项

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 楼主| 发表于 2020-11-5 15:35:22 | 显示全部楼层 |阅读模式

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在任何实验之前,验证和优化所使用的试剂是很好的做法。 在流式细胞术中,这些试剂通常是指特异性抗体。 使用过多或过少的抗体都会导致非特异性染色增加,信噪比降低,灵敏度降低,表达水平与染色强度之间缺乏线性关系,增加了实验成本。 因此,为实验确定最佳抗体浓度是非常重要的,这一点怎么强调都不为过。 抗体的最佳浓度或“滴度”必须根据检测目标、染色条件(即染色时间和温度)以及批次而定。 活细胞可能与固定细胞有不同的最佳染色条件,细胞表面染色的蛋白质与细胞内染色的相同蛋白质不同。 由于商业试剂不太可能在您所用的特定实验条件下进行测试,因此也应该始终进行滴定,而不是按照制造商推荐的滴度或浓度使用。

为确定染色抗体的最佳效价,建议对抗体进行连续稀释。 如果不知道从哪个浓度开始,通用起点是10μg/mL抗体,然后按1:2顺序稀释6至8个梯度。 在实际实验中,用于滴定的细胞数应与染色的细胞数相对应。 然而,虽然细胞数量影响染色质量,但在相当大的密度范围内,例如10E5-5×10E6个细胞,染色往往相当稳定的。 一旦滴定,抗体浓度通常在细胞浓度的10到50倍范围内提供相似的染色质量。 如果细胞浓度增加超过这一点,通常将抗体浓度增加两到三倍就足够了,或者快速进行两到三步滴定就足够了。

一旦制定了滴定梯度,有几种方法可以评估数据以确定最佳滴定。 最简单的方法是计算阳性群体(如CD4单抗染色)的MFI与阴性群体的MFI的比率,即SNR(见下图,另外考虑到阴性群体的CV,还有一个染色指数的指标,可能更好,见:https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4540-1-1.html)。 最佳分离就是信噪比最高的,像下图这样,0.68μg/mL或1:800稀释是最佳浓度。 20201104_164336.jpg

需要考虑的其他方面包括:
1. 在使用抗体时,抗体的浓度是最关键的参数,即当实验放大到更大的体积染色时,需要相应地增加抗体的量,以保持浓度不变。
2. 在滴定抗体时,确保阴性细胞群不表达感兴趣的抗原,这有助于正确评估背景染色。 如果群体中没有“阴性”细胞,可以考虑在细胞中掺入阴性细胞。
3. 一旦确定了最佳滴度,在发表结果时,请注明最佳染色的染色抗体浓度,而不是稀释倍数。
4. 如果可能,使用多个标记共染的方法,识别与要滴定的标记共表达或非共表达的细胞亚群。这将有助于确认滴定抗体的特异性。

发表于 2020-11-11 15:22:45 | 显示全部楼层
倪老师,请问一个Panel中的抗体可以一起染色滴定吗?还是一定要一个一个抗体滴定?
发表于 7 天前 | 显示全部楼层
请问抗体滴定的话,也要做死活细胞染色吧?谢谢
 楼主| 发表于 7 天前 | 显示全部楼层
wsjheaven 发表于 2020-11-25 13:47
请问抗体滴定的话,也要做死活细胞染色吧?谢谢

一般不用,因为都需要新鲜标本,新鲜标本基本都是活的
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