为什么会存在荧光补偿？如何调节？看图！

niwanmao

流式细胞术的优点是同时可以进行多参数检测，从4色到20多色，快速并且信息量大，然而，不同荧光之间，可能存在的补偿，给很多新手造成了极大的困扰。
荧光之间为什么会存在补偿？以FITC和PE为例，下图中显示的是两者的发射光谱，很明显，两者之间存在很大的重叠，这就意味着FITC发出的光，可能被PE检测器检测到，反之，PE发出的光，也能被FITC检测器检测到：



为了调节补偿，我们需要分别借助FITC单染标本，从PE检测信号中减掉漏过去的FITC荧光，借助PE单染标本，从FITC检测信号中减掉漏过去的PE荧光，最后形成如下图所示的样子，分别使Q1和Q3的FITC MFI相等、使Q4和Q3的 PE MFI相等：




但在实际使用过程中，我们要求尽量接近，不一定要使他们的MFI完全一致。
下面是三幅Diva软件中补偿调节的结果图片，a图代表的是正确补偿，b图代表的是过度补偿，c图代表的是补偿未调节到位，大家可以观察一下绿色和红色框内的数字，体会一下正确进行补偿调节的真谛。

niwanmao

白晶晶2019 发表于 2019-11-18 10:47
倪老师，多色流式是每种荧光素都买CD3的抗体吗？用单参数直方图调节补偿？ ...

是的，只是染的细胞需要是T细胞才行。

niwanmao

白晶晶2019 发表于 2019-12-13 19:56
老师，如果用B、T细胞群用的荧光素相同，还要再调补偿吗？还是因为目的细胞群不同，渗漏比例可能不同，还 ...

细胞不同，荧光渗漏应该一样才对。

白晶晶2019

niwanmao 发表于 2019-11-18 19:31
是的，只是染的细胞需要是T细胞才行。

老师，如果用B、T细胞群用的荧光素相同，还要再调补偿吗？还是因为目的细胞群不同，渗漏比例可能不同，还要再调？

白晶晶2019

niwanmao 发表于 2017-5-9 22:16
多色调节补偿，可以采购几个荧光素覆盖各通道的CD3抗体。

倪老师，多色流式是每种荧光素都买CD3的抗体吗？用单参数直方图调节补偿？

niwanmao

archerliang 发表于 2019-4-8 14:12
倪老师，你贴的那三张图使用单染管做的吗？那为什么会同时有fitc和pe的阳性？ ...

这是因为细胞群里面，同时有两者单阳性的细胞。例如我做淋巴细胞的CD4和CD8染色，由于同时存在这两种抗体单阳性的细胞，所以也会出现这种分布。

archerliang

倪老师，你贴的那三张图使用单染管做的吗？那为什么会同时有fitc和pe的阳性？

bryant2483341

niwanmao 发表于 2018-1-4 18:10
具体的算法我不太清楚，应该是自己寻找阳性群和阴性群，然后通过计算，将两者中位数调到一致吧 ...

好的，谢谢

niwanmao

bryant2483341 发表于 2018-1-4 17:13
倪老师，请问软件实现自动补偿有什么算法吗？

具体的算法我不太清楚，应该是自己寻找阳性群和阴性群，然后通过计算，将两者中位数调到一致吧

bryant2483341

niwanmao 发表于 2017-11-4 09:36
单染管是比较标准的推荐，并且容易让软件来帮你自动计算补偿。
但如果补偿做得熟练的话，并且你的细胞群 ...

倪老师，请问软件实现自动补偿有什么算法吗？